床标本中的许多细菌和病毒，但其敏感性尚不够满意。如果PcR技术与核酸探针杂交技
术结合起来，可使检测的敏感性大为提高，特异性亦可大大增强。
近年来发展起来的实时荧光定量PcR技术（real—time PcR）是通过始点定量和荧光
检测系统实时监测累积荧光强度而实现核酸定量的一种技术，具有全封闭单管扩增、灵敏
度高、特异性强、线性关系好、操作简单、无扩增后处理步骤等优点，目前已经应用于临
床多种病原体的快速检测。
基因芯片技术（gene chip或DNA microarray）是近年来发展快速的前沿技术，其原
理是将大量核酸片段（寡核苷酸、PNA、cDNA、基因组DNA）以预先设计的方式固定
在载玻片、尼龙膜和纤维素膜等载体上组成密集分子阵列，与荧光素或其他方式标记的样
品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的有无和数量。该技术具有
高通量、自动化程度高、快速、样品用量少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点。病原
微生物的16S rDNA及23S rDNA序列近几年被作为一个较理想的基因分类靶序列，其在
进化压力下保持了高度的保守性，同时又具有一定的变异性，基因芯片技术通常利用病原
微生物的这一分子生物学特性，实现多样本多病原微生物的同时检测。
病原体核酸检测不仅适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物，而且适用
于检测核酸变异的病原微生物。变异是病原微生物适应环境和维持生存的一种重要方式。
不同物种变异速率不一，病毒是变异率比较高的微生物。病毒变异不仅对病毒感染性疾病
的治疗、预后构成不利，同时还影响到病毒感染的正确诊断。基因芯片技术和探针标记技
术成为解决这一问题的可能途径。它们不仅能对病毒进行基因分型，还能检测病毒可能的
耐药基因区域，预测其发生耐药的可能性和耐药程度。随着分子生物学技术的不断发展，
检测试剂盒的标准化和商品化，操作更简便易行，基因芯片技术和探针标记技术无疑将会
成为感染性疾病快速诊断的重要手段之一。
（四）病原体的分离培养和鉴定
1．细菌感染性疾病病原体的分离培养 分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤。
根据临床症状、体征和镜下检查特征作出病原学初步诊断，选用最合适的培养方法，主要
是选择适当的培养基、接种前的标本处理和确定孵育条件，然后根据菌落性状（大小、色
第九章临床常见病原体检测
泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等）和细菌的形态、染色性，检测细菌生化反
应结果和血清学实验、动物接种实验（白喉杆菌），对分离菌作出鉴定，也可借助于微量
鉴定系统快速简便鉴定分离菌。在鉴定细菌的同时，需做抗生素药物敏感试验。
2．不能人工培养的病原体感染性疾病 将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养。
接种动物后，可根据动物感染范围、动物发病情况及潜伏期，初步推测为某种病原体。接
种于鸡胚的病毒，根据不同接种途径的敏感性及所形成的特殊病灶，有助于初步鉴定。细
胞培养的病毒，可依据细胞病变的特点或红细胞吸附、干扰现象、血凝性质等缩小病毒的
鉴定范围，最后用血清学方法作最后鉴定。
（五）血清学实验
用已知病原体的抗原检测患者血清中相应抗体以诊断感染性疾病。人体感染病原体后
经过一定时间产生特异性抗体。这种抗体在体内可维持数月或更长时间，因而检测抗体不
仅可用于现症诊断，而且还是疾病追溯性调查的一种方法。血清学诊断对于某些病原体不
能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据，但是，抗体检出最早也需在感染4～5天
以后，一般在病程2周后效价才逐渐增高，因而它不适于疾病的早期诊断。在作血清学诊
断时，一般要在病程早期和晚期分别采血清标本2～3份检查，如抗体效价在病程中呈4倍
以上增长者有现症诊断价值。若每次抗体效价无变化，则可能是因为隐性感染或回忆反应
所致，而不能做现症感染的诊断。单份血清一般诊断意义不大，除非检测IgM。病人血清
内IgM的检测有重要意义，不仅可做早期诊断，而且可区分原发性感染和复发性感染，
前者急性期血清检出IgM，而后者为IgG。常用的血清学检测方法有凝集试验、沉淀试
验、补体结合试验、间接免疫荧光技术、放射免疫测定、酶联免疫吸附试验等。血清学诊
断试验的价值常用敏感性、特异性和预测值来评价。临床医生必须合理选择试验项目达到
确诊某一疾病、排除某一疾病或监测疾病治疗的效果（表4—9—1）。
表4—9—1 病原体检测方法、判断和速度
第二节 病原体耐药…陛检测
抗菌药物是目前临床使用最为广泛的药物，它的发现、研制和临床应用是现代医学史
上的重要里程碑，使绝大多数微生物感染，尤其是细菌感染成为可治性疾病。但抗微生物
药物的广泛使用所造成的“抗生素压力”（antihiotic pressure）也使原来占优势的敏感菌
株被抑制和杀灭，原来是少数劣势的固有耐药菌株或诱导出的获得耐药菌株则繁衍成抗菌
药物主要使用环境（如医院、诊所内）的优势菌株，使临床医学在感染控制上面临严重的
挑战。了解耐药发生机制和耐药性监测，熟悉常见耐药菌株的耐药特点，是临床医学生的
一个重要任务。
一、耐药性及其发生机制
（一）耐药病原体
目前临床感染的病原微生物以革兰阴性菌居多（约占六成），主要是铜绿假单胞菌、
大肠埃希菌、克雷伯菌和肠杆菌属细菌等，主要耐药类型有以p一内酰胺酶介导的耐p一内
酰胺类抗生素的革兰阴性杆菌；质粒介导的产超广谱B一内酰胺酶（extra—spect…rum bet？a
lactamase，ESBL）的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等；染色体编码产生工类8一内酰胺酶的
阴沟肠杆菌和产气肠杆菌等；另外多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和不动杆
菌属细菌等都已成为临床上感染性疾病治疗的棘手问题。革兰阳性菌引起的感染约占三
成，以葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和血浆凝固酶阴性的葡萄球菌）和肠球菌为主，重要的
耐药菌株有耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistant staphy．10cct】s，MRs）、耐青霉素肺
炎链球菌（penic川in reSl’stant streptc）COCCIJs pnetlm（）nia，PRSP）、耐万古霉素肠球菌（va—
comycin resistant enteroc（）CCLts，VRE）和高耐氨基糖苷类抗生素的肠球菌等。不仅细菌可
产生耐药，病毒也出现了耐药病毒株，导致抗病毒治疗逃逸现象发生。如HBV发生突变，
对核苷类似物药物（如lamivudine拉米夫定和famciclovir华美可维等）产生耐药。
（二）耐药机制
对某种抗菌药物敏感的细菌变成对该药物耐受的变异称为耐药性变异。细菌的耐药性
变异已成为当今医学的重要问题。细菌耐药性的获得可以通过细菌染色体耐药基因的突
变、耐药质粒的转移和转座子的插入，使细菌产生一些酶类（灭活酶或钝化酶）和多肽类
物质，通过下述几种机制导致细菌耐药：
1．细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统 整合子（integrOil）是捕获外源基因
并使之转变为功能性基因的表达单位，通过转座子和接合质粒在细菌中传播的遗传物质。
整合子的基本结构由1个编码整合酶（integrase）的IntI基因、2个基因重组位点attI和
attc、启动子和耐药基因盒组成。目前已确定有60多个耐药基因盒，常见的有：①aad基
因盒：编码氨基糖苷类的耐药性。②dfr基因盒：编码甲氧磺胺嘧啶类的耐药。③编码0一
内酰胺酶和超广谱p～内酰胺酶。④其他基因盒：cat基因编码对氯霉素的耐药；aac：基因
编码对氨基糖苷类的耐药；aar基因编码对利福平的耐药；ere基因编码对红霉素的耐药。
2．产生灭活抗生素的水解酶和钝化酶等 常见的有：①ESBI。s：由质粒介导的、能赋
予细菌对多种p一内酰胺类抗生素耐药，它主要由革兰阴性杆菌产生。②AnlpO p一内酰胺
酶（AmpC p—lactamases）：是革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的丝氨酸头孢菌素
酶组成的一个酶家族，几乎对所有的口一内酰胺类药物耐药。③碳青霉烯酶：碳青霉烯酶
主要水解碳青霉烯类抗生素，表现为对碳青霉烯类抗生素高度耐药。按Ambler分子分类
为A、B、D 3类酶，A类酶见于一些肠杆菌科细菌，D类酶仅见于不动杆菌；B类酶为金
属酶，见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌。④氨基糖苷类钝化酶：是细菌对氨
基糖苷类抗生素获得性耐药的主要机制，通过质粒介导能使氨基糖苷类抗生素失活。
3．细菌抗生素作用靶位的改变靶位结构的改变，是引起细菌耐药的一个重要因素。
如MRS是由于染色体上？…Fie（：A基因编码产生低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP2a），以至
青霉素不能抑制细菌细胞壁的合成；VRE的耐药是由于细菌染色体的改变，编码产生的
酶导致与万古霉素作用的靶位改变；大肠埃希菌DNA拓扑异构酶Ⅱ的gryA基因突变，
可造成对喹诺酮类中所有药物交叉耐药等。
4．细菌膜外排泵出系统 细菌依靠主动外排泵出机制来减少细菌内药物浓度，如铜
绿假单胞菌有3套外排泵出系统，MexAB—oprM、MexCD—oprJ、．MexEF—oprN等。
5．细菌生物膜的形成 细菌生物膜（biofilm，BF）是指附着于有生命或无生命物体
第九章 临床常见病原体检测
表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。与浮游菌相比，生物膜中细菌对抗生索
的耐药性可提高lo～1000倍，其耐药性主要取决于其多细胞结构：①生物膜中的胞外多
糖起屏障作用，限制抗生素分子向细菌运输。②生物膜中微环境的不同可影响抗生素的活
性。③诱导细菌产生特异性表型。④多菌种的协同作用。具有生物膜的细菌多见于铜绿假
单胞菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、变异链球菌。
细菌的多种耐药机制可协同作用，导致多耐药菌株的出现。
二、检查项目、结果和临床应用
常用的检查细菌是否对药物耐药的方法有定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法
和E试验法。对某些特定耐药菌株的检测除药物敏感试验外还要附加特殊的酶检测试验、
基因检测等方法。
（一）药物敏感试验
1．K—B纸片琼脂扩散法（Kirby—Bauer disc agar diffusion method） 世界卫生组织
推荐的标准纸片扩散法，是由Kirby和Bauer建立的。将含有定量抗菌药物的纸片贴
在接种有测试菌的M—H琼脂平板上置3 5℃孵育16～18h。用游标卡尺量取纸片周
围透明抑菌圈的直径，参照CLSI（Clinical and Laboratory Standard Institute）标准判读
结果，按敏感（susceptible，S）、中度敏感（intermediate，I）、耐药（resistant，R）
报告。S：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制