实验室手册- 第10节

免疫球蛋白

SPA
免疫球蛋白
SPA
小鼠IgG1
IgG24
IgG24
IgG6
IgM
IgA
IgE
兔IgG
鸡IgG
＋（—）
＋
＋
—
—
—
—
＋
— 山羊IgG1
　　　　　IgG2
绵羊IgG1
　　　　　IgG2
猪IgG
猫IgG
豚鼠IgG

—
＋（—）
—
＋
＋
＋
＋
—

（二） 羊抗鼠Ig交联Sepharose　　4B以提纯小鼠Ig
　　　注意：溴化氰易挥发，如果吸入或通过皮肤吸收有巨毒，所有接触CNBr设备应浸在NaOH中，在通风橱里过夜，然后将氰化物洗掉。
1、 以1升水用真空抽滤的方法Sepharose　　4B（10ml沉淀体积），去除防腐剂（不要完全抽干），重悬于水中，总体积为18ml，置于50ml的烧杯中。
2、 加入2ml碳酸盐冲液（0。5M碳酸钠PH10。5）和磁力搅拌　子；在通风橱中搅拌；将PH　电极置于悬液中；检查搅拌器和PH计的工作情况。
3、 戴好手套；小心将1。5克CNBr（避免大颗粒）倒入小瓶中。（在通风橱中完成这项工作是安全的，先称小瓶和瓶盖子的重量，然后在通风橱中往小瓶中加CNBr，小心盖紧盖子，移出通风橱称重，原来装CNBr的瓶子的药勺留在通风橱中）。
4、 缓慢的搅拌Sepharose悬液，监测PH并加入固体CNBr（将药勺和空小瓶置于1M　　NaOH中），逐滴加入4M的NaOH　以保持PH在0。5—11。0；直至固体CNBr全部溶解以及PH降低的速度减慢（10—15分钟）。
在此过程中如果PH高于11。5；则弃去Sepharose；重做。
5、 用烧结玻璃或布氏漏斗过滤混合物，用2升冷柠檬盐缓冲液（0。1M　PH6。5柠檬酸钠；预冷却至4℃）迅速洗涤Sepharose（不要完全干）；小心处理过滤器（含CNBr）。
6、快速将活化的Sepharose加到IgG溶液（100mg溶于10ml柠檬酸缓冲液中置于
4℃）中，置于转动混匀器上，使之不断的轻轻混匀，4℃
过夜。如果没有转动混匀器，则轻轻搅拌混合物1小时，然后静置过夜）。
7加1ml乙醇铵溶液，继续轻轻搅拌1小时，以确保安全去除活性基因。
8让Sepharose自然沉降，上清用500g离心5分钟，在280nm测上清液吸光度，计算未偶联到Sepharose上的IgG百分率。假设上清液的总体积为11ml（蛋白溶液＋乙醇胺）加5ml（10ml　　Sepharose的内部液体体积）。IgG未偶联率小于10％，通常为1—5％。
9、将IgG—Sepharose　　装于合适的柱（可将多孔圆盘放在注射针筒骨来制造一个简单的柱）中，用PBS洗涤，柱中加入含0。1％叠氮钠的PBS；4℃
保存。
　　　　　　　　　10分离提纯Ig同前述可参阅有关资料。IgG—Sepharose有时要用同类动物正常Ig封闭之。
　　　　　　　　　　成功范例：提纯培养上清中的单抗。
第二节 几种常用抗原的制备
一、 脂多糖抗原制备
（一） 粗制LPS制备，参见第六章
（二） 精制LPS制备
1、 粗制LPS经3倍95％酒精，37℃水浴作用15分钟；离心后，沉淀物以蒸馏水配成3％溶液。
2、 超速离心100000Xg　　4小时。上层为上清液，中间层为沉淀的LPS胶体，下层为粘液样沉淀物。
3、 吸弃上清，小心取出沉淀物的LPS胶体（中间层）。
4、 将LPS溶解在原体积的1/2蒸馏水中，再离心一次。
5、 沉淀的LPS溶液于少量DW中，冻干保存。
超离后分层情况
（三） 多糖抗原制备：
1、将LPS　　　200mg溶解在20ml　　1％醋酸溶液中，以移入带塞的试管中。
2、　　100℃水浴30分钟。
3、 5000Xg离心沉淀类脂，吸取上部液体，装入透析袋中，4　℃透析48小时。
4、 冻干提取的多糖，产量为LPS的30——、40％。
　　　　　成功范例：沙门氏菌A—F群LPS提取。
二沙门氏菌鞭毛抗原的制备
　　1、将半固体培养基筛选活泼动力的单相沙门氏菌血清型接种到10mlM肉汤中，37℃
16小时。
2、 再移种到500ml　　M肉汤中，37℃16小时。
3、 400ur/m离心30分钟，收集细菌。
4、 以适量生理盐水悬浮菌泥，并用1N盐酸调至PH7。0；室温轻度振荡30分钟。
5、 1000r/m　30分钟。上清中含有大量脱落下来的鞭毛素。
6、 以1NnaOH将上清调至PH7。2。
缓慢加入饱和硫酸铵溶液；边加边搅拌；达67％饱和硫酸铵浓度后；4℃过夜。
　　　　　　8次日将上清以15000r/m4℃离心20分钟。
9、 将沉淀物溶解于2ml蒸馏水中。
10、 过Sephacryl　　S300层析柱（2。0X50cm）；用Tris—HCL缓冲液洗脱，流速20ml/小时，收集第一峰，测定蛋白质浓度，分装保存。若对提纯要求不高，可以省略此步。
11、 提纯鞭毛素的质量鉴定
（1） SDS—PAGE：在非降解和降解条件下于10％凝胶SDS——PAGE垂直板上电泳（KB—2301电泳仪），恒流，25Ma/板，10℃电泳5小时。
（2） 凝胶用三氯醋酸溶液固定过夜色。用考马斯亮兰G—250染色。
（3） 计算蛋白带分子量：Ha　　50000，Hb　53000，Hd46000。
　　12提纯鞭毛素的等电点测定—IEF
（1） 取60ul样品溶解在9M脲和1％2—巯基乙醇中。
（2） 上样于含有2％Ampholin（PH3。5—9。5）（LKB　　Bromma，Sweden）和6M脲的4％聚丙烯酰胺凝胶（用22。2％聚丙烯酰胺和1。4％　　双甲丙叉烯酰胺原液配制）。
（3） 蛋白质在LKB　　1117—003多功能电泳仪上，恒流4mA待电聚焦至电压250—300V。
（4） 电泳5小时后，用10％三氯醋酸固定凝胶，经40％乙醇洗涤后，用0。1％考马斯亮兰G250染色过夜；再用14％醋酸脱色。
（5） 确定PH梯度凝胶，从阳极端切成0。5cm长度；分别装入小试管内；加去离子水1小时后；用酸度计或PH试纸测PH值；划出PH梯度斜线；并确定样品的等电点。（Ha5。1；Hb5。1　　Hd4。9）。

三、 粘附素抗原的制备
（一） K88、K99和K987p的制备
1、 将G—7或E68、C83907和UP001在37℃培养16—20小时。
2、 从克氏瓶中洗下，用0。1M　PBS（PH7。0）悬浮。
3、 62℃水浴振荡20分钟使粘附素脱落。
4、 8000r/m20分钟，其上清液用10％乙酸调PH至4。5，4℃放置过夜，使K88粘附素沉淀（等电点沉淀）。
5、 以8000r/m离心，将沉淀物用0。1M　　PBS溶解。
6、 经Sephadex　G200柱层析（2。6X80cm）纯化，用0。01M　　PBS（PH7。0）作为平衡液及洗脱液；流速为1ml/分。
7、 收集第1峰；合并前半峰即为纯化K88抗原。。
8、 测定蛋白质浓度，小量分装，—30℃保存备用。
（二） K99抗原的制备
1、 K994529在Minca培养基上37℃培养18小时。
2、 磷酸盐尿素缓冲液洗下菌细胞。
3、 60℃加热孵化20分钟，离心后去菌体，上清加60％饱和硫铵，4℃搅拌2小时。
4、 离心收集沉淀，悬浮沉淀对上述缓冲液透析16小时。
5、 进一步经Sephadex　　CL—4B柱层析纯化，浓缩后再经SephadexG—50脱盐。

（三） 987P抗原的制备
1、 C88710　Slane培养基37℃20小时培养。
2、 生理盐水洗下菌笞，离心收集菌体。
3、 菌泥中加入400ml含2M尿素0。01M　PBS，60——63℃　1—1。2小时。
4、 60％饱和度硫酸铵沉淀离心上清。
5、 离心后，沉淀物再过Sepharose　　4B柱。
6、 收集第一峰前半峰，浓缩后经Sephadex　　G50脱盐。
（四） F48抗原的制备
1、 C95707、C85919和B41M分别接种Minca培养基上，37℃18小时。
2、 灭菌0。05M　　PH7。2　PB收集菌体。
3、 62℃水浴加热处理1小时，并不时振动，离心去菌体。
4、 上清置4℃72小时，等电点4。6沉淀　法使粘附素沉淀　。
5、 离心后；将沉淀于Separose　　CL—4B纯化，以含2M尿素0。05M　PH7。2　PBS洗脱；洗脱液浓缩后再脱盐。
附：各种粘附素等电点。
　　　　　K88　　　　　　　　　4。2
　　　　　K99　　　　　　　　　9。7
　　　　　987P　　　　　　　　3。7
　　　　　F41　　　　　　　　　4。6
四、 全菌抗原的制备
1、 丙酮灭活菌制备参见前述。
2、 甲醛灭活全菌制备：以0。4—0。6％甲醛生理盐水与新鲜肉汤培养物等体积混灭菌，经PBS洗涤后，配成1—10X10（6）/ml，4℃保存备用　。
3、 热灭活全菌制备：将鲜培养物以DW稀释至10亿/ml细菌，100℃水浴2小时，离心吸取上清（另一种抗菌原），菌泥进一步用PBS洗3次，保存备用　。
4、 酒精灭洗全菌制备。
五、 病毒抗原的制备
（一） 鸡新城疫病毒提纯—“层析法”
1、 鸡红细胞吸附释放法。
鸡红细胞　吸附表面有一种糖蛋白受体，在4℃时，病毒被吸附到红细胞　膜的受体上，但在37℃时病毒的N—乙酰神经氨酶破坏受体的糖苷键后，病毒又可以从红细胞　膜　上释放。操作步骤如下：
（1） 感染病毒的鸡胚囊液，在4℃下6000r/m，30分钟，弃沉淀。
（2） 上清液根据病毒血凝滴度的高低，加入1—3％的新鲜洗涤的鸡红细胞，在4℃下吸附1—2小时。
（3） 3000r/m0分钟，弃去上清。
（4） 吸附有病毒的红细胞重悬浮于1X钙盐水中（含4％CaCL2的生理盐水），在37℃下放置2—4小时。
（5） 3000r/m20分钟取上清。
（6） 28000r/m小时，沉淀重悬于小容积的生理盐水中，即为初步纯化病毒。
2、 解脱后的病毒蛋白液再上Sepadex　　G—200柱，以PBS洗脱，收集第1峰。即为进一步纯化的NDV。
（二） NDV纯化—离心法
1、 NDV种毒以灭菌生理盐水作1：100稀释，再接9—11日龄SPF鸡胚的绒毛尿囊腔内（0。1—0。2ml/胚）。
2、 37℃孵化，每天照蛋两次，收获24—96小时死亡鸡胚的澄清无菌之尿囊液，测血凝价，分装—30℃保存备用。
3、 尿囊液经5000Xg　　30分钟。
4、 取上清102732Xg离心30分钟。
5、 再取上清用20％蔗糖垫底，110000Xg离心2。5小时。
6、 取沉淀用少量PBS悬浮，经10—60％蔗糖等到密度性梯度离心，91000Xg　　16小时（BecKman，L7，SW28）。
7、 收集含病毒的蔗糖区带。
8、 用PBS稀释上清，110000Xg离心2。5小时。用小量PBS悬浮沉降病毒，小量分装，—70℃保存备用。
（三） NDV　　HN　　NP　　F蛋白制备—SDS—PAGE。
附：聚乙二醇法浓缩病毒
在病毒悬液中加入一定量的PEG6000。在此条件下，病毒可随其他大分子物质发生沉淀。操作步骤如下：
（1） 收获经病毒感染的尿囊液，6000r/m30分钟，弃沉淀。
（2） 上清液中加入7。5％的PEG　和0。1—00。4MnaCL，4℃下放置2—4小时。
（3） 6000r/m30分钟，收集絮状沉淀物，重悬于小容量的缓冲液内。
六、 MDV羽囊琼扩抗原制备，从略。
七、 IBDV琼扩抗原制备，从略。
八、 转铁蛋白制备：利凡诺—低温乙　醇分级沉淀法。
1000ml血浆
　　　　　　　　　　　　　　　加与血浆等到体积的2。0％利凡诺（内含1％Na2CO370ml），
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　边加边搅拌产生黄色粘性沉淀物（为白蛋白）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　校正上清PH8。1—8。2，静置3—4小时
（　白蛋白沉淀）弃　　收集上清液
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加1％活性吸附利凡诺（20分钟）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　抽滤，得澄清滤液
　　　　　　　　　　　　移入—10℃冷冻
　　　　　　　　　　　　用1M　Hac调PH7。0—7。2
　　　　　　　　　　　　加乙醇终浓度为25％（乙醇要用Hac调PH7。0—7。2）
　　　　　　　　　　　　校正PH7。0—7。2
　　　　　　　　　　　　—60—70℃放2小时
　　　　　　　　　　　　—4℃离心20分钟（20000r/m）
（球蛋白沉淀）弃