似傅搅硪欢耍沽奖叩呐嘌虾玫叵嗤āＥ嘌欢问奔浜螅〕隽蕉说南妇⒎直鹜坎加诓煌幕九嘌希裁挥腥魏卧途涑鱿帧Ｕ庖皇匝橹っ鰽菌株和B菌株细胞之间的直接接触或称结合（conjugation）是基因重组的前提。
图5…19 戴维斯（Davis）的U形管试验示2个细菌之间的物理隔离
5。4。1。2 F因子及F因子的转移
1952年，W。Hayers用链霉素处理前述A菌，然后再将A菌与B菌杂交，所生成的原养型重组体的数目没有减少；反过来，用链毒素先处理B菌，再与A菌杂交，可以完全阻止重组作用的发生，这说明细菌接合中遗传物质转移是一种单向过程即遗传物质从A株转移到B株。因此人们把细菌分为2个类群，即2种接合型，一种为供体或雄性菌，另一种为受体或雌性菌。决定雄性的是染色体外的一个共价环状的DＮＡ分子，称为致育因子（fertitility factor）或Ｆ性因子，也称为Ｆ质粒。雄性供体细胞以Ｆ＋表示，雌性受体细胞没有Ｆ因子用Ｆ－表示。Ｆ因子决定的主要表型是细胞表面的性伞毛，它是细胞进行物理接触所必需的。Ｆ因子的DNA是环状的，大小约是细菌基因组DNA的2％，相对分子质量为4。5×106；长约94。5kb（1 kb=1000个碱基对），整个基因组编码94种蛋白质，其中1/3的基因与接合作用有关。
L。Cavalli…Sforza曾用氮芥气处理A菌，从中分离到一个突变株，当用这个突变株与B菌杂交时，重组体出现频率比A×B高出1000倍，他将这个菌株命名为高频率重组型Hfr（high frequency rebination）。后来发现Hfr就是F因子的DNA整合到细菌的染色体内的菌株。
因此，F因子能够以3种状态存在：①细菌细胞没有F因子，即F…；②包含一个自主状态的F因子，即F＋；③包含一个整合到自己染色体内的F因子，即Hfr（图5…20）。
图5…20 大肠杆菌F因子的3种状态
F＋×F…杂交 当把F＋和F…细菌混合培养时，几分钟内，不同类型的细胞间便形成接合桥（conjugation bridge）。结合桥是由F性伞毛形成的，它诱导F因子上traYz基因表达，产生核酸内切酶。该酶在oriT转移起点处一条单链上切开一个切口，F DNA以线状单链从5′末端开始向受体转移，互补链留在供体中。在37℃时，F DNA转移的速度约是每分钟104个核苷酸。同时，F＋和F…细胞内，以2条单链为模板，在DNA聚合酶Ⅲ参与下迅速合成双链DNA。F…细胞接受了F因子能迅速地复制并很快地扩散到原始的F…群体中，把它们为F＋（图5…21）。F因子从供体向受体的转移过程包括细胞间接触、接合管形成、单链断裂、单链DNA从供体向受体转移。在F＋×F…杂交中，虽然F因子以很高的频率转移，但供体染色体的传递则极少（只有10…6～10…7），由F因子带动的染色体基因转移只是个别和少数基因片段。如有连续的基因转移，可能是F＋群体中偶然存在Hfr变异所致。
图5…21 F＋×F…和Hfr×F…中F因子转移示意图
（a）在F＋×F…交配中，F因子从供体转移到受体细胞 （b）在Hfr×F…交配中，转移到
受体细胞中的F因子和细菌基因通过整合产生Hfr菌株
Hfr×F…杂交 Hfr是F因子插入到染色体上形成的菌株，F因子插入到染色体上的频率约为每代10…5～10…7。F因子的插入并不是随机的，在染色体上有许多特定的插入位点，它们与Ｆ因子上的插入序列有极大的同源性。Ｈfr×F…细菌杂交与F＋×Ｆ…有相同的Ｆ因子转移过程。当Hfr的细菌染色体进入F…后，在一个短时间内，对细胞中某些位点来说，是一段二倍体的DNA。这样的细菌称为部分二倍体（partial diploid）或部分合子（merozygote），其中来自供体的DNA称外基因子（exogenote），受体染色体则称为内基因子（endogenote）图（5…22a）。部分二倍体发生单数交换，会使环状染色体打开，产生一个线性染色体，使细胞不能成活。发生偶数次交换，才能产生遗传的重组体，外源基因才能整合到寄主的染色体并中使细菌染色体保持环状结构（图5…22c）。
图5…22 部分二倍体形成及单交换和双交换的后果
（a）部分二倍体形成 （b）单数次交换产生线状染色体 （c）双交换产生有活性
的重组子和片段。片段在以后的细胞分裂中丢失，所以不会出现相反的重组子
结合过程通常在DNA转移尚未完成时就己自行中断，但有时Hfr在结合桥断裂之前可将其整个染色体转移到受体细胞中，使受体细胞转变成Hfr。
5。4。1。3 中断杂交实验绘图
1957年E。Wollman和E。Jacob设计了著名的中断杂交试验（interrupted mating experi…ment）。试验中供试的Hfr菌株对链霉素敏感（strs），对叠氮化物有抗性（azir），对T1噬菌体有抗性（tomAr），对半乳糖（garl＋）和乳糖（lac＋）都是原养型。
Hfr菌株的基因型是strs azir tonAr tonAr gal＋ lac＋ 。
F…菌株的基因型是strr azis tonAs gal… lac… 。
他们将大约10倍的F…菌株与Hfr对数生长期细菌混合培养，每隔一定时间间隔取样，在食品搅拌器中剧烈振荡以中断杂交，分开已经紧密接合的供体…受体杂交对。然后将振荡后的培养物接种到含有链霉素的完全培养基上，杀死所有的Hfr细菌，以便选择结合后体即含有供体基因的抗链霉素的受体细菌。然后对形成菌落的F…细胞用影印法测试其基因型，结果见图5…23。从图中可以看到在接合作用开始后的9min，最早出现的重组体有10％含Hfr菌的azir基因，但几乎还没有tonAr、lac＋、gal＋基因。25min时，gal＋基因才出现。随着时间推移，从Hfr得到的某个等位基因重组体的百分率增加。如在11min时，tonAr首先在重组体中出现，15min后达到40％，25min后达到80％。其他即使增加时间，其重组百分数也不会改变。
图5…23 中断杂交后，重组体中Hfr遗传性状出现的频率
各标记基因进入F…细胞中的时间不同，达到最高水平的时间也不同
标记基因在受体细胞中出现频率完全取决于重组频率，而且Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入F 细胞。由于每单位长度的染色体迁移之速度是保持不变的，因此，每个基因进入F…受体细胞的时间就给它们提供了遗传图距的尺度。离转移原点（orgin；O）越近，进入F…细胞越早，反之则晚。Wollman和Jacob曾把图5…23的实验结果绘制成直线连锁图：
O
F因子能够整合到染色体的许多位置，表5…3就是用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序。尽管每个菌株的基因转移顺序有所不同，但转移的顺序并不是随机的。例如，his基因都有gal在一边，gly在另一边。这种基因转移的差异就是由于各个Hfr菌株间F因子在染色体上的整合位点和整合方向不同，能形成不同原点和转移方向的缘故。
表5…3 用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序
Hfr 基因转移顺序
HfrH 0 Thr Pro lac pur gal his gly thi
1 0 Thr Thi gly his gal Pur lac pro
2 0 Pro Thr thi gly his gal pur lac
3 0 Pro Lac Pro thr thi gly his gal
AB312 0 Thi Thr pro lac pur gal His gly
如果我们将表5…3中的各种Hfr菌株的基因顺序当作一个环状结构来考虑，则这5种中断杂交结果都是相同的。例如在HfrH中，首先转移的基因是thr；最后转移的是thi；而在Hfr1中这2个基因则是一个接一个转移的（首先是thr；然后是thi）。所以只有这2种Hfr菌株都是环状染色体，二者的基因顺序才会相同，只是转移起点○（DNA复制起点）不同。再看AB312，这2个基因转移的顺序是thi转移在先，然后是thr；同其他菌株的差别只是转移方向和转移起点不同。根据表5…3资料，绘制5个大肠杆菌环状染色体图如图5…24。J。Cairns（1960）利用电子显微镜观察到大肠杆菌的DNA确实是环状DNA分子，后来大家自然就接受了大肠杆菌的环状染色体图。
图5…24 大肠杆菌5个Hfr菌株的环状染色体图
在大肠杆菌以及其他的细菌中，除了存在F因子外，还存在其他一些感染因子。同F因子一样，当它们在细胞质中以自主状态存在时，便被称为质粒。有些质粒不能整合到染色体上，还有一些质粒同F因子的行为相似，可以整合到染色体上，如温和性噬菌体等。这类既可以整合到细菌染色体上，又可自主存在于细胞质中的质粒称为附加体。
5。4。1。4 大肠杆菌的环状染色体图
在中断杂交实验中，主要是根据基因转移的先后次序，以时间分钟（min）为单位，求出基因间的距离。如果2对基因间的时间单位接近2min，用中断杂交实验测定基因间的正确图距就不很可靠，最好用传统的重组作图法。例如，在Hfr lac＋ ade＋×F…lac…（乳糖不发酵）ade…（腺嘌呤缺陷型）的中断杂交实验中，己知lac…ade2个基因是连锁的，且ade是最后进入F…受体的，那么，完全培养基中不添加腺嘌呤，长出的菌落则为接合后体F…ade＋。因为ade＋是最后进入细胞的，转移顺序在前面的lac＋自然也己进入。所以在我们选出的F…adc＋中，一定是由同时得到lac＋和ade＋的部分杂合体。如果我们得到F…ade＋的同时是lac＋，表明lac…ade之间没有发生过交换；如果是lac…，表明在这2个基因之间发生过交换（图5…25）。所以求lac…ade两基因间的距离或重组频率可用下式表示：
重组值=
中断杂交实验己证明lac…ade这两个基因间的距离是1min。用重组作图法，算出的重组值是20％。因此，时间单位和重组值的关系大致为1个时间单位（1min）相当于20％的重组值。所以，两基因间的距离以时间为单位在接近2min时，测得的基因间距离就不那么可靠。
图5…25 外基因子与内基因子的重组
（a）重组子同时含有供体标记基因lac＋，基因型是lac＋ade＋
（b）重组子只含有ade＋，基因型是lac…ade＋
根据中断杂交和基因重组作图法以及其他基因定位实验的结果，己绘制出大肠杆菌环状的遗传学图（图5…26）。
图5…26 大肠杆菌环状染色体图
示大肠杆菌环状染色体图上部分基因
5。4。2 转化
5。4。2。1 转化的发现
转化（transformation）最初是指细菌细胞从周围介质中吸收来自另一不同基因型细胞的DNA而使它的基因型和表型发生变化的现象，是细菌中最早发现的遗传物质转移形式。1928年，英国学者F。Griffith在利用肺炎双球菌（Diplococcus pmeanomiae）感染家鼠的试验中，把不产荚膜的无毒的粗糙型肺炎双球菌和加热杀死后的产荚膜的有毒光滑型肺炎双球菌混合注射小鼠，意外发现小鼠被感染致死，而且还从小鼠的血液中分离出活的产荚膜的肺炎双球菌，从而发现了转化现象。1944年美国化学家Avery等从元素分析、酶学分析、血清学分析以及生物活物鉴定等方面证实了无细胞提物中引起肺炎双球菌荚膜转化的转化因子是DNA。