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在友人的推荐下，洪堡德被介绍给了皇室，获得觐见西班牙国王的机会。
西班牙国王很赏识洪堡德在地质方面的才智，因而允许他们前往南美探险。
国王批准他们可以到南美任何一个地区，条件是他们必须把在南美发现的矿产资源或贵金属的有关情况向国王提交书面报告。
从此，他们的研究室不再是狭窄的建筑物，而是整片广大无垠的南美洲大陆。基于对科学研究的浓厚兴趣，他们在南美作了长途跋涉，走过漫天风沙的地区，越过湍急的河流，用双手开拓出密密丛林中的小径，摸索着安第斯山的冰柱前进。洪堡德将他的观察和发现写成长达20卷的书，“洪堡德”也成了美洲一座山脉、太平洋一股海流、三种矿物、31种花卉和一个国家公园的名称。朋卜兰德则发现了3500种新种植物，以他名字命名的就有几十种，这个数目是当时世界上已知植物数量的2倍。
1799年6月5日午后，洪堡德和朋卜兰德这两位日后令全世界吃惊的冒险家出发了。他们从西班牙西北部的拉科鲁尼港向加勒比海的古巴群岛急驶而去。开航时，正是英法战争前夕，拿破仑扬言要攻下英国，因而有名的英国无畏舰队封锁了欧洲各个重要港口。洪堡德和朋卜兰德为了不被英国舰队发现，特意选择了暴雨天开航。由于风势太大，英国舰队只好停泊在离海岸较远的海面上，两名学者即刻抓住这个机会，令船长将“毕扎罗”号轻型巡洋舰驶出港口。船紧沿着海岸行驶，巨浪使它摇晃不已，一行人也就听天由命地开始了冒险行程。
在历时41天的航行中，洪堡德和朋卜兰德日以继夜地忙碌着，他们调查海中的鱼类，收集各种海草，解剖海蜇，在甲板上来回奔忙。海浪在他们脚下翻卷着，海鸟像箭似地穿过空中，发出刺耳的声音。云破月出，琥珀般的光点散在海波上，船上的钟缓缓地敲着。。当船停靠在加纳利群岛的圣塔库兹港后，两人立刻登上匹科得德地火山。在爬到火山口时，让他们震惊的是，海拔1200米高的火山裂口的温度高达93℃。洪堡德记着：“高温的硫磺气把我们的衣服烧成破洞，可是，我们的手指却因处在…11℃的高山上而冻得僵硬。”
为了打发漫长航程中的无聊，洪堡德逐日将船走过的路线记载在自制的地图上，结果他发现，过去300年来所使用的法、英、西班牙等国绘制的海图错误百出。他预言在7月15日，船可见到陆地，果真7月16日他们抵达库马纳港，比船长按照海图的推测日期早3天。登陆后，洪堡德利用空闲时间调查了海岸线，他成为第一位南美洲东北部海岸线正确位置的绘制者。
在库马纳停留一个时期之后，两人再度出发。他们将行李装上骡子后，便朝山区往西走，越过崎岖不平的山顶窄路，抵达加拉加斯。两位科学家在无路可走的密林中前进，夜间燃起篝火，听着一种叫“瓜科罗”的南美洲夜莺的歌声。他们考察了叫做“龙血”的一种奇异的植物，它的白色树皮染着紫色的液汁。
此后，他们又继续朝南，横越草原，来到奥里诺科河的支流阿浦来河畔的一个称为“圣费南多”的小村落。在这个村落附近干燥多风沙的热带雨林区中，洪堡德和朋卜兰德调查了此处的草本植物，才知道在洪水季节时，这里会变成一个巨大的内陆海，在内陆海中，这块雨林区将成为浮出海面的几座土堆。他们发现了咖啡树和甘蔗的乐园，发现了一种“乳树”，属于桑科，在它的树干里可收集到牛奶般的液体，在漫长闷热的夏季，这是一种很好的营养饮料。
一天，两位科学家在沼泽区游泳，事后，村民们对他们能够生还无不感到意外。那片沼泽地中布满了被印第安人称之为“得隆布拉特列斯”的带电的鳗鱼。电鳗能在马腹下游过，电击马的心脏，让马淹死在河里，也会使人麻醉而死。获此消息后，两位好奇的科学家决心研究这种古怪的电鳗。他们告诉印第安人：活抓电鳗有重赏。次日，他们又来到沼泽地，只见印第安人正赶着一大群马朝电鳗栖息的地方走去。印第安人想用众多的马使电鳗用尽电力，然后再活捉之。洪堡德、朋卜兰德站在岸边观看，发现被赶下去的马痛苦地嘶吼着，时而踢前脚，时而蹬后腿，有几匹马已经耐不住电击而昏倒、溺死。等到电鳗对人体不构成威胁时，印第安人使用他们的草帽将电鳗抓上来。
洪堡德得到电鳗后，用脚对着挣扎的电鳗踩了一下，顿时，全身猛遭电击，向后仰倒，眼前一片昏黑，全身的肌肉急剧地抽痛。良久，这种感觉都没有消失。他们动手解剖了一条电鳗，研究结论是，产生这种致命电力的是它肌肉中的纤维组织。
他俩做了一艘能放上桌子和皮制椅子的筏子，向阿浦来河下游出发。白天他们在筏子上工作，夜晚，居宿吊床，以满天繁星为帐篷。露营生活并非如想象中的那般浪漫，白天需要忍受飞虫的叮咬，晚上从远方常传来美洲虎撕人心肺般的吼叫。洪堡德的宠物小狗，被吸血蝙蝠咬伤后，又被两只美洲虎瓜分了。
假如他们不慎翻船，那只能命归黄泉。河两边排满了可怕的鳄鱼，它们七八只一群，在沙滩上静静地躺着，张开大嘴晒太阳，或悄然潜行在筏子周围，露出恐怖的眼睛。每年都有不少印第安人消失在鳄鱼的巨嘴之中。洪堡德数着鳄鱼的个数，发现它们的长度都超过6米。奥里诺科河的鳄鱼是世界上最大的鳄鱼种类。
虽然河边不时出现可怕丑陋的鳄鱼群，可是并没有减少航行中的乐趣，两岸美好的景色给他俩留下了深刻的印象。身披各种鲜艳色彩的金刚鹦鹉以清脆悦耳的叫声配合着钟鸟和鸽子婉约的鸣声，宛如一首动人的协奏曲。水牛、貘等动物也在浅水中优闲地游着，野狗和狼在草地上追逐，树獭悬挂在树枝之间，大獾蜷伏在隐密的树干和树根四周。当船朝下游驶进时，不时有色彩缤纷的蝴蝶飞翔而过。有时候，当地的白猴会抓住垂下的树藤，荡过船首，长啸一声而去。洪堡德和朋卜兰德以赞美的心情欣赏着大自然的一切。
1800年3月，也就是在库马纳登陆8个月后，洪堡德和朋卜兰德到了奥里诺科河。洪堡德对河的宽度做了测量。以前的测量结果为4公里，但洪堡德知道奥里诺科河的宽度是按不同季节变化的。此时正值亚马孙河上游地区春季，河水泛滥，倒灌奥里诺科河，所以洪堡德测得的河宽为11公里，但这仍比不上亚马孙河雨季时的80公里的河宽。
沿着奥里诺科河缓缓而下，在船舵前面，印第安划手们双双并排而坐，并随着桨声的节奏，唱着他们的乡土小调。船舱里装着各种动物和植物。当科学家们泊船上岸时，他们在露营处周围燃起篝火以赶走老虎。进入内陆后，眼前一片深邃的森林，密密麻麻的植物已经挤得没有再长植物的空隙，地表上有如铺着厚厚一层地毯。
到达奥里诺科河上游的一个小岛，正逢当地印第安人一年一度的乌龟蛋收获季节。每年这种体重70公斤的大乌龟，会在旱季时集中爬上河洲生蛋。
乌龟蛋中的油是当地人不可或缺的调料，小乌龟的肉十分香美。洪堡德和朋卜兰德看到印第安人先从河洲中将蛋挖出，装进空的独木舟，然后，用棒将蛋捣破，冲水，再将浮油捞出，放入桶中储存。大约6000只蛋可得一加仑蛋油。
他们循着奥里诺科河的瀑布群继续往上游驶去。几个月后，他们改乘独木舟，因为唯有这种狭窄的独木舟才能顺利地驶过激流。他们以蹲踞的姿势坐在以圆木挖成的长9米、宽仅90厘米的独木舟上，直抵黑河。
抵达奥里诺科河瀑布时，有人劝告他们不要再继续前进。50年前，一支由325人组成的探险队，为了寻找连接奥里诺科河与黑河的河道来此地而迷了路，只有13人生还。但是，洪堡德并不气馁，他有成功的信心，他知道连接两个水道的卡西圭拉河，早在200年前就被西班牙士兵罗培·德·阿吉利成功地渡过。此外，在1639年，一个名叫克拉斯多巴尔·德·阿克诺的旅行家也确认有这条河的存在。
此时，航行的障碍已不是激流，恶劣的环境几乎到了令人忍无可忍的地步。他们的皮肤被壁虫咬得红肿流血，更叫人心寒的是那些会引起疟疾的蚊子。为了免遭攻击，他们只能把沙子盖满身体，仅露出头部睡觉。发霉变坏的标本也无法逃过蚂蚁的糟蹋。迫不得已，朋卜兰德只好将几十只盛满植物标本的盒子扔到河里。
心惊胆战的事有增无减，食物越来越少，每日三餐只能用掺有大蚂蚁的米充饥。奥里诺科河自亚特伍列斯上溯之后，有长11公里、落差15米的湍流区，白色的水沫溅击两岸，两岸长满滑溜的青苔。为了能安全越过激流，他们只好将独木舟扛在肩上，踏着青苔如履薄冰地渡过此地。沿途他们收集到许多稀奇古怪的动物和鸟类。越过激流之后，奥里诺科河向东转去，他们在小支流亚塔巴伯河离开主流，进入比密基河不久就抵达了黑河。面对黑河，他俩惊叹不已，黑河的污浊如墨的河水与黄色的比密基河水竟然如此泾渭分明。黑河在玛瑙斯流入亚马孙河时，这种差别更为显著，几公里后两河河水才混合为一。
抵达黑河后，洪堡德和朋卜兰德再向卡西圭拉河驶去。根据阿克诺神父的记载，卡西圭拉河与奥里诺科河会合在一起。洪堡德在此河的起点处停下来，他测量出它的位置是北纬2°0′4″。传说中的卡西圭拉河就这样确认无疑了。由于黑河以南的土地隶属葡萄牙，为了安全起见，他们放弃了经黑河到亚马孙河的打算，改由阿吉利所走的路回到库马纳。
归途中，他们在一个偏僻的小村落借宿于一个几乎已有10年没有看到白人的西班牙神父家中。在杂草丛生的密林之中，他们还发现了一间与世隔绝的小屋，主人是一个会说西班牙语的白人，他的双脚都被虫蜇伤，以致看不出原来的肤色。他颇以白人特殊的身份为荣，在这片无垠的丛林中，他是当地仅存的欧洲人。
在整个旅行中，洪堡德对印第安种族特别有兴趣，他发现各原始民族的习惯和传统之间有着惊人的相似之处，就像某些植物的种系，尽管存在着气候与地区的不同，但仍保持着一种共同类型的印记。
人类的家族成员印第安人生活在这几�