1939年5月5日，蔡元培长女、油画家蔡威廉死于难产后猩红热，年仅35岁。蔡威廉虽是因病去世，但缘由却是学生闹学潮，蔡威廉夫妇被迫离开学校，二人没有收入，故不能住院生产，以致最后病逝。临终前，她还用手在墙上反复疾书“国难，家难……”周峻得知威廉死讯后，恐蔡元培过于伤心，一再隐瞒，女婿林文铮来函亦在后附上威廉之名掩饰。但随后蔡元培从报纸上看到女儿遗作展览的消息，方知爱女已不在人世，一时悲痛万分，备受打击。
蔡元培的眼睛上长了一颗东西，但他并不说明，仍是照常看报。直到1939年夏周峻发现后才延医诊治。医生让他动手术，但因他年老体弱便未进行手术。后来另一医生用药水给他洗眼睛，但此后便不能在灯下看书太久。
1940年春，蔡元培接到一封电报，脸色突变，大概缘于此前威廉之死让他大受刺激，此次以为又有祸事发生。之后，周峻请医生前来诊治，认为血压低，并无大碍。3月2日夜，周峻陪蔡至3日凌晨4点，蔡坚持让周去休息，周峻便回房就寝。到早晨6时，蔡元培起床如厕，回房时因体虚摔倒，周峻闻声赶来，赶紧将他扶上床，半小时后，蔡突然吐血多口，血色黑紫。医生前来诊治，认为唯有输血，但蔡年事已高，怕输血吃不消。在医生建议下，蔡被送到养和医院住院治疗。
次日下午2点半左右，蔡元培“面上忽现惊慌之色，口啊啊几不能言，两手紧握抽动，做抵拒状”，几分钟后才平静下来。医生赶来，认为最后的办法就是输血。
下午6时，医生开始给蔡元培做肛滴，蔡难受至极，几次用在他嘴里难得听到的愤怒的口吻说：“还不好，真是要命。”肛滴结束抽出皮管时，从其肛中带出半盘血水。
而医生此时还找不出病症，一位认为是脑溢血，一位认为是胃破裂。两位医生辩论时，蔡元培开始呓语，周新走进仔细聆听，隐约分辨出几句：“……世界上种种事故，都是由于人们各为己利。……我们要以道德救国，学术救国，……我蔡某人生有四个儿子……”
当夜12时许，医生准备为蔡元培输血，因为验血设备在香港大学，医生寇克便带着蔡的血样和周新、蔡元培的侄儿蔡太冲、自愿献血的陈林龢到港大验血。检验后，决定由蔡太冲为蔡元培输血。他们赶回养和医院，此时蔡已不能正常呼吸，只是往外吐气，眼皮已经不瞬动，两手冰冷。输血过程中，蔡元培的眼皮开始瞬动，呼吸也转为正常。输完血后，已是凌晨3点，蔡元培睁开眼睛，饱含泪水，看着周峻，如同久别重逢，默默地点了点头。寇克医生这才离去，其他人也都散去了，只留下周峻和周新守在床前。
输血完毕后几小时，蔡元培又陷入昏迷。早晨7时，蔡仍没有清醒的迹象，呼吸反而开始困难。周峻忙请来一位姓叶的医生，问能不能给蔡再输一次血，叶满口答应，说去拿手术用具。但等了好久，却不见叶返回，大家去找，却被告知他在手术室为别人施术。到上午9时许，寇克医生赶到，认为蔡流出的血太多，输入的血不足以补亏，已回天乏术。1940年3月5日9点45分，蔡元培永远停止了呼吸，享年73岁。
蔡元培去世后，全国不分政治派别，均表深切哀悼。3月9日，中共中央发来唁电，并派廖承志前往香港致唁；10日，灵柩出殡，由北大学生护送，香港各学校及商号下半旗志哀，执绋者五千余人，万余人参加公祭，极尽荣哀。16日，重庆国民政府发布褒扬令，称蔡元培“道德文章，夙负时望”，“推行主义，启导新规，士气昌明，万流景仰”，并拨付5000元作为丧葬费用。24日上午，全国各省市均举行隆重的追悼大会，蒋介石参加了国民党各界在重庆为蔡元培举行的公祭。5月9日，国民政府发布国葬令，为蔡元培举行国葬。
教育部、北大的诔词说：“当中西文化交接之际，先生应运而生，集中西文化于一身；其量足以容之！其德足以化之！其学足以当之！其才足以择之！呜呼！此先生所以成一代大师欤？”
周恩来挽蔡元培：“从排满到抗日战胜，先生之志在民族革命；从五四到人权同盟，先生之行在民主自由。”毛泽东唁电云：“学界泰斗，人世楷模”。
举殡之日，迦露连山上，万头攒动，数千男女学生，肃立南华体育场，静待蔡元培灵榇经过。除了风拂旗帜，不闻半点声息。平日热闹的迦露连山，寂寂如荒村残宵一般。蔡氏的灵榇，由北大校友扶持，徐徐经过，再绕南华体育场一匝，向万千青年致最后纪念。
蔡元培灵柩初移厝于东华义庄七号殡房，准备待战事平息后归故乡绍兴安葬，后因炮火连绵，未能成行，遂移葬于香港华人永远坟场，长眠于香江之畔。
【仰止】
翁同龢称赞少年蔡元培：“年少通经，文极古藻，隽才也。”
刘晓钢评价蔡元培：“到蔡元培的《论国文之趋势》、《国文之将来》，便正式把文章分为实用文和美术文（即艺术文）两大类，开始创立独立的实用文理论了。”
傅斯年说蔡元培：“大凡中国人以及若干人，在法律之应用上，是先假定一个人有罪，除非证明其无罪；西洋近代之法律是先假定一人无罪，除非证明其有罪。蔡先生不特在法律上如此，一切待人接物，无不如此。他先假定一个人是善人，除非事实证明其不然。”
傅斯年又言：“蔡元培先生实在代表两种伟大文化：一曰，中国传统圣贤之修养；一曰，西欧自由博爱之理想。此两种文化，具其一难，兼备尤不可觏。先生殁后，此两种文化，在中国之气象已亡矣！”
周作人与蔡元培为绍兴同乡，他“从小时候就听人说蔡元培是一个非常的古怪的人，是前清的一个翰林，可是同时又是乱党。家里有一本他的朱卷，文章很是奇特，篇幅很短，当然看了也是不懂，但总之是不守八股的规矩，后来听说他的讲经是遵守所谓公羊家法的，这是他的古怪行径的起头。他主张说是共产公妻，这话确是骇人听闻，但是事实却正是相反，因为他的为人也正是与钱玄同相像，是最端正拘谨不过的人。他发起进德会，主张不嫖，不赌，不娶妾，进一步不做官吏，不吸烟，不饮酒，最高等则不做议员，不食肉，很有清教徒的风气。他是从佛老出来，经过科学影响的无政府共产，又因读了俞理初的书，主张男女平等，反对守节，那么这种谣言之来，也不是全无根据的了。可是事实呢，他到老不殖财，没有艳闻，可谓知识阶级里少有人物。我们引用老辈批评他的话，做一个例子。这是我的受业师，在三味书屋教我读《中庸》的寿洙邻先生，他以九十岁的高龄，于去年逝世了；寿师母分给我几本他的遗书，其中有一册是《蔡孑民言行录》，书面上有寿先生的题字云：‘孑民学问道德之纯粹高深，和平中正，而世多訾嗷，诚如庄子所谓纯纯常常，乃比于狂者矣。’又云：‘孑民道德学问集古今中外之大成，而实践之，加以不择壤流，不耻下问之大度，可谓伟大矣。’”
杜威评论蔡元培：“拿世界各国的大学校长来比较，牛津、剑桥、巴黎、柏林、哈佛、哥伦比亚等等，这些校长中，在某些学科上有卓越贡献的，固不乏其人；但是，以一个校长身份而能领导那所大学，对一个民族、一个时代，起到转折作用的，除蔡元培而外，恐怕找不出第二个。”
汪原放说：“蔡元培道貌温言，令人起敬，吾国之唯一人物也。”
冯友兰说：“蔡元培是近代确合乎君子的标准的一个人。”“蔡先生的人格，是儒家教育理想的最高的表现。”
冯友兰评价蔡元培：“一介寒儒，书生本色。”他说：“我在北京大学的时候，没有听过蔡元培的讲话，也没有看见他和哪个学生有私人接触。他所以得到学生们的爱戴，完全是人格的感召。道学家们讲究‘气象’，譬如说周敦颐的气象如‘光风霁月’。又如程颐为程颢写的《行状》说程颢‘纯粹如精金，温润如良玉，宽而有制，和而不流。……视其色，其接物也如春阳之温；听其言，其入人也如时雨之润。胸怀洞彻视无间；测其蕴，则浩乎若沧溟之无际；极其德，美言盖不足以形容’。这几句话，对于蔡元培完全适用。这绝不是夸张。”
吴稚晖感佩道：“蔡先生为人，真是所谓‘君子和而不同’。他和那一个人都很和气。然而他……绝不会因为做人和气，就会人云亦云。蔡先生所到之地，谁和他相处，都……如坐春风之中，不过虽坐春风之中，很感到有一种严肃之气。如果我们以之比古人，蔡先生很像周公，‘不骄不吝’，‘一沐三握发，一饭三吐哺’。什么事情也是‘仰而思之，夜以继日，幸而得之，坐以待旦’。俨如周公风度。至对人，则亦‘尊贤而容众，嘉善而矜不能’。只要这个人有一技之长，没有不取其所长，绝不问其短处如何。……蔡先生平时待人，对好人没有不尊敬；对坏人，也没有不宽恕。”
1943年3月5日，《新华日报》发表题为“怀念蔡孑民先生”的社论，指出：“北大是中国革命运动史上、中国新文化运动史上，无法抹去的一个名词。然而，北大之使人怀念，是和蔡孑民先生的使人怀念分不开的。蔡先生的主办北大，其作风，其成就，确是叫人不容易忘怀的，确是对于中国的革命事业有很大的贡献的。”
林语堂认为蔡元培“软中带硬，外圆内方”。1967年，林在《想念蔡元培先生》一文中说：“蔡先生就是蔡先生。这是北大同人的共感。言下之意，似乎含着无限的爱戴及尊敬，也似乎说天下没有第二个蔡先生。别人尽管可有长短处，但是对于蔡先生大家一致，再没有什么可说的。”
梁漱溟评价蔡元培：“蔡先生一生的成就不在学问，不在事功，而只在开出一种风气，酿成一大潮流，影响到全国，收果于后世。这当然非他一人之力，而是运会来临，许多人都参与其间的。然而数起来，却必要以蔡先生居首。”“总之，我了解的蔡先生，其伟大在于一面有容，一面率真。他之有容，是率真的有容；他之率真，是有容的率真。更进一层说：坦率真诚，休休有容，亦或者是伟大人物之所以为伟大吧。”
梁漱溟说：“蔡先生的了不起，首先是他能认识人，使用人，维护人。用人得当，各尽其才，使每个人都能发出自己的热和光，这力量可就大了。”
郭沫若说：“影响鲁迅生活颇深的人，应该推数蔡元培先生吧。这位精神博大的自由主义者，对于中国文化教育界的贡献十分宏大，而他对鲁迅先生始终是刮目相看的。鲁迅的进教育部乃至进入北京教育界都是由于蔡先生的援引，一直到鲁迅的疾殁，蔡先生是尽了他没世不渝的友谊的。”
蒋梦麟评论老师蔡元培：“先生日常性情温和，如冬日之可爱，无疾言厉色。处事接物，恬淡从容，无论遇大观推刃或引车卖浆之流，态度如一。但一遇大事，则刚强之性立见，发言作文，不肯苟同。故先生之中庸，是白刃可蹈之中庸，而非无举刺之中庸。”“先生做人之道，出于孔孟之教，一本于忠恕两字。知忠，不与世苟同；知恕，能容人而养成宽宏大度。”
任鸿隽说：“在公义一方面，�
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